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Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 9483 (2022) Citar este artículo

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Las nanopartículas lipídicas (LNP) para la administración de ARN y ADN han atraído una atención considerable por su capacidad para tratar una amplia gama de enfermedades y vectorizar ARNm para vacunas contra la COVID. Los LNP se producen mezclando biomoléculas y lípidos, que se autoensamblan para formar la estructura deseada. En este dominio, la microfluídica muestra claras ventajas: alta calidad de mezcla, condiciones de bajo estrés y preparación rápida. Los estudios de LNP producidos en micromezcladores han revelado, en ciertos rangos de caudales, una degradación en el rendimiento en términos de tamaño, monodispersidad y eficiencia de encapsulación. En este estudio, nos centramos en el micromezclador de anillo, que se adapta bien a un alto rendimiento. Revelamos tres regímenes, uno al lado del otro, de transición y altamente mixto, que controlan el rendimiento de mezcla del dispositivo. Además, utilizando crio-TEM y análisis bioquímico, mostramos que los rendimientos de mezcla están fuertemente correlacionados con las características de los LNP que producimos. Hacemos hincapié en la importancia de la relación de caudal y proponemos un criterio físico basado en la aparición de inestabilidades temporales para producir LNP con características óptimas en términos de geometría, monodispersidad y rendimiento de encapsulación. Estos criterios son de aplicación general.

Muchos avances se han hecho en la última década. De hecho, desde que aparecieron los primeros micromezcladores a principios de siglo, se han desarrollado aproximadamente cien dispositivos funcionales basados en varios conceptos. Todos ellos tienen ventajas y desventajas, pero en general, los usuarios suelen encontrar geometrías correspondientes a su aplicación de interés en el catálogo de mezcladores microfluídicos1,2,3. En los últimos años ha surgido la idea de utilizar estos dispositivos para producir LNP (nanopartículas lipídicas)4,5. Los LNP se han convertido en el estándar de oro para la administración de ácidos nucleicos6. Son nanopartículas complejas, de 50 a 100 nm de diámetro, compuestas principalmente de lípidos ionizables catiónicos que pueden segregarse de los otros componentes lipídicos cuando se neutralizan sus cargas, lo que lleva a la formación de gotitas de aceite amorfas en el núcleo de los LNP, como se describe en un estudio reciente7,8. La molécula terapéutica en el LNP depende de la aplicación. Puede ser ADN, ARNm o ARNip. Las entidades funcionales atrapadas o adsorbidas en la interfaz incluyen fracciones de PEG (generalmente unidas a una cadena de lípidos), lípidos auxiliares y colesterol. Las nanopartículas de lípidos ofrecen muchas ventajas sobre los sistemas anteriores de administración de ácidos nucleicos basados en lípidos: alta eficiencia de encapsulación de ácidos nucleicos, transfección más potente, penetración mejorada en los tejidos y baja citotoxicidad e inmunogenicidad. Estas características hacen que las nanopartículas lipídicas sean excelentes candidatas para la administración de ácidos nucleicos, como lo demostraron las vacunas contra la COVID basadas en ARNm.

Los LNP se forman a través de un proceso de autoensamblaje. Las simulaciones numéricas sugieren que el proceso de autoensamblaje incluye tres pasos: ensamblaje de partículas en grupos discoidales, agregación de grupos en parches de membrana más grandes y formación de vesículas9. El autoensamblaje por difusión sería demasiado lento (llevaría días), por lo que se necesita una mezcla hidrodinámica. El uso de mezcladores estándar5 en contenedores grandes es una opción. Sin embargo, estos mezcladores generan polidispersidad de tamaño junto con una baja eficiencia de encapsulación. Por lo tanto, se requieren pasos de posprocesamiento como filtración, extrusión y centrifugación para mejorar la calidad de los LNP producidos de esta manera. En este contexto, el uso de mezcladores de microfluidos es relevante. Recientemente se ha demostrado que la microfluídica permite la producción de LNPs de calidad aceptable en términos de monodispersidad y rendimiento de encapsulación en un solo paso con altos rendimientos. En Fujishima et al.10 y Shepherd et al.11 se utilizó un micromezclador espigado escalonado12. Una limitación de los micromezcladores en espiga es su bajo rendimiento. Esta limitación se puede eludir paralelizando el sistema11. Sin embargo, esta opción genera complejidad, aumenta el costo y reduce la confiabilidad. Los micromezcladores inerciales que operan a velocidades de flujo significativamente más altas y, por lo tanto, mayores rendimientos ofrecen una solución, pero hasta ahora, aunque se pueden encontrar algunas indicaciones en la literatura, las condiciones en las que deben operarse para obtener LNP funcionales aún no se han dilucidado por completo.

En el presente artículo, nos centramos en un micromezclador basado en Dean13,14,15,16,17, miembro de la clase de micromezcladores inerciales. Está bien adaptado a altos rendimientos y, por lo tanto, a la producción en masa. Identificamos, de acuerdo con los cálculos numéricos18, tres dominios de caudales. Uno de ellos, denominado 'régimen de transición', jugará un papel importante en la identificación de las condiciones óptimas de flujo. Para obtener LNPs con características óptimas en términos de eficiencia de encapsulación (EE), tamaño, carga y monodispersidad, mostramos que debemos operar a caudales por encima del régimen de transición. Trabajar por debajo o dentro del régimen de transición, aún en términos de caudales, conduce a un rendimiento degradado. De acuerdo con la literatura, describimos así las condiciones físicas bajo las cuales se pueden obtener LNP de calidad aceptable utilizando un criterio físico que no ha sido propuesto previamente. También discutimos el importante papel de la relación de velocidad de flujo entre la fase acuosa (que contiene los ácidos nucleicos) y la fase orgánica (que contiene los lípidos).

En nuestra formulación de LNP, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1,2-dimiristoil-rac-glicero-3-metoxipolietilenglicol-2000 (DMG-PEG2000) y colesterol (derivado de plantas) fueron adquirido de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EE. UU.). Dlin-MC3-DNA, en lo sucesivo denominado MC3, se obtuvo de SAI Life Science (Hyderabad, India). El ácido cítrico y el citrato de sodio tribásico deshidratado se adquirieron de Sigma-Aldrich (Francia). La solución salina tamponada con fosfato 10X (PBS, pH 7,4) se obtuvo de Thermo Fisher Scientific (Francia). El plásmido gWiz-GFP se adquirió de Aldevron (Dakota del Norte, EE. UU.).

Para producir LNP, los lípidos se solubilizaron en etanol en proporciones molares de 50:10:38,5:1,5 para MC3, DOPC, colesterol y PEG-lípido, respectivamente. La mezcla de lípidos se mezcló con tampón de citrato 50 mM a pH 4 que contenía ADNp usando el cartucho de microfluidos NxGen (de Precision NanoSystems, Vancouver). La relación nitrógeno a fosfato (N/P) entre el lípido ionizable y el pDNA se mantuvo en 6. Los efectos de la velocidad de flujo (FR; oscilando entre 0,4 y 20 ml/min), la relación acuosa a orgánica (FRR; de 1:1 a 10:1) y se evaluaron las concentraciones finales de lípidos y ADNp (de 1,44 a 15 mg/ml y de 93 a 965 µg/ml, respectivamente, para lípidos y ADNp). Para todas las formulaciones, los volúmenes de residuos inicial y final se establecieron en 0,45 y 0,05 ml, respectivamente. Después de procesar la formulación en el micromezclador, se eliminó el etanol del producto y se eliminó el tampón de citrato mediante PBS utilizando filtros ultracentrífugos Amicon (EMD Millipore, Billerica, MA). Finalmente, las formulaciones se pasaron por un filtro de 0,22 μm y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.

El tamaño de partícula, el índice de polidispersión (PDI) y el potencial zeta se midieron mediante dispersión de luz dinámica utilizando un Malvern Zetasizer NanoZS (Worcestershire, Reino Unido). Los LNP se diluyeron 100 veces en PBS y se añadieron a una cubeta µ. Los valores de índice de refracción (RI) y viscosidad del dispersante (PBS) fueron 1335 y 1,02 cP, respectivamente, mientras que el RI del material fue 1,45.

La eficiencia de encapsulación de pDNA se determinó utilizando el ensayo de ADN PicoGreen (Life Technologies, Burlington, ON). Brevemente, se añadieron 100 μl del tinte fluorescente diluido a 100 μl de LNP diluidos en presencia o ausencia de Triton-X100 al 1 % (p/v) en tampón TE y se incubaron en ausencia de luz durante 5 min. Los ácidos nucleicos se cuantificaron midiendo la fluorescencia (ex/em = 480 nm/520 nm) utilizando un fluorímetro (lector de microplacas Varioskan Lux, Thermo Fisher). Se realizó una curva de calibración lineal de hasta 1000 ng/ml utilizando la muestra de ADN estándar proporcionada en el kit.

La relación de encapsulación se calculó mediante la siguiente fórmula:

La morfología de los LNP se observó mediante microscopía crioelectrónica. Se depositó un total de 4,1 µL de LNP concentrados en rejillas de malla 300 de cobre Quantifoil R2/2 (Quantifoil Instruments GmbH, Alemania) después de 90 s de descarga luminiscente en un ionizador ELMO (Cordouan, Francia). Las rejillas se secaron y congelaron usando un Vitrobot MARK IV (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) y se transfirieron a un TEM tecnai-G20 (ThermoFisher Scientific, EE. UU.) operado a 200 kV usando un soporte criogénico 910 (Gatan, Inc., EE. UU.) para observación. Las imágenes se registraron con un desenfoque de 4 µm y en modo de dosis baja (dosis de electrones entre 10 y 15 e-/Å2) utilizando un ssCCD Ultrascan 4000 (Gatan, Inc., EE. UU.). El tamaño de píxel de las imágenes registradas se estimó en 0,221 nm después de la calibración TEM utilizando una cuadrícula de líneas cruzadas (EMS, EE. UU.) con un espaciado de paso de 500 nm y 2000 líneas/mm.

El dispositivo de microfluidos utilizado para producir LNP se muestra en la Fig. 1.

(A) Imagen del microdispositivo lleno de una solución de fluoresceína. (B) Bosquejo del microdispositivo que muestra la Secc. 1, la región de entrada y la Secc. 2, incluidos los cuatro anillos y las uniones entre ellos. En los experimentos del modelo de fluido, Q1 es agua y Q2 es etanol con 0,1 % p/p de fluoresceína. En los experimentos de LNP, Q1 representa la fase acuosa que contiene el ácido nucleico diluido en un tampón ácido y Q2 representa la fase de etanol que contiene los lípidos. (C) Vista tridimensional del dispositivo, que muestra las cuñas asociadas con la técnica de moldeo de microfabricación. Las dimensiones de los canales se midieron por perfilometría óptica (ver Fig. 2).

El sistema incluía una serie de cuatro toros conectados por canales rectos. El dispositivo fue microfabricado con tecnología de moldeo de plástico (Ignite® de Precision NanoSystems Inc. Ltd., Vancouver, BC, Canadá). La Figura 2 muestra la sección transversal del canal de salida ubicado aguas abajo de los cuatro anillos, como se muestra en el recuadro (ver la línea discontinua blanca).

Perfil de la sección transversal del canal de salida (ver la línea discontinua en el inserto), con y representando la dimensión horizontal (es decir, en el plano del dispositivo) y z la altura. La función z(y) define así el perfil del canal, tomando como referencia el fondo del canal (z = 0). Se muestran dos conjuntos de datos: mediciones de intensidad (círculos), suponiendo proporcionalidad entre la intensidad de fluorescencia y z(y), y mediciones de perfilometría óptica Veeco (líneas rojas).

El perfil de la Fig. 2 se obtuvo llenando los canales con una solución de alcohol y fluoresceína, imaginándolos con un microscopio de fluorescencia, recolectando el campo de intensidad con una cámara y analizando las imágenes con una computadora. Cuanto mayor sea la altura del canal, mayor será la intensidad recogida. Trabajando con bajas concentraciones de fluoresceína (0/1 % p/p) para evitar la decoloración, asumimos la proporcionalidad entre la intensidad de fluorescencia captada por la cámara y la altura del canal. Comprobamos que los perfiles obtenidos de esta forma coincidían totalmente con la perfilometría óptica (ver la línea roja de la Fig. 2, obtenida con el perfilómetro óptico Veeco). Debido a la tecnología de microfabricación utilizada (moldeo por inyección), las paredes del canal no eran verticales sino ligeramente inclinadas. De la Fig. 2 se obtienen ángulos de aproximadamente 80° formando lo que llamamos "cuñas" por oposición con la parte central del canal para el cual la altura es constante. En este contexto, definimos el ancho del canal w como la distancia entre las dos paredes inclinadas en el nivel del plano medio. En nuestro análisis de mezcla, despreciaremos estas cuñas y nos centraremos en las partes centrales, que transportan la mayor parte del material que queremos producir (en la cuña, debido al confinamiento, el fluido, sujeto al mismo gradiente de presión que en la parte central). parte, está esencialmente estancada, y podemos suponer que no contribuye al proceso de producción). La rugosidad de la superficie estimada a partir de la perfilometría óptica fue de 3 ± 1 µm. Esto es típico de la tecnología de inyección sin procesamiento posterior de la superficie. Como el flujo es conducido muy por debajo del inicio de la turbulencia (ver más abajo), esta rugosidad no juega ningún papel dinámico.

Los canales tienen la misma profundidad (155 µm -medida por perfilometría óptica-) y diferentes anchos. En la Fig. 1, los toros tienen 150 µm de ancho, los canales de conexión 150 µm y los canales de entrada y salida 280 µm de ancho (como se muestra en la Fig. 2). El dispositivo tiene dos entradas. Los canales de entrada forman una Y que está conectada al primer toro.

El caudal total está definido por Q = Q1 + Q2, donde Q1 y Q2 son los caudales de los fluidos inyectados en las dos entradas (ver Fig. 1). En nuestro sistema, se realizaron dos tipos de experimentos:

Modelo de experimentos con fluidos: en este caso, Q1 corresponde al agua DI y Q2 a la solución de etanol de fluoresceína a una concentración de masa del 0,1 %.

Experimentos LNP: En este caso, Q1 representa la fase acuosa que contiene el ácido nucleico en un tampón ácido y Q2 representa la fase de etanol con los cuatro lípidos solubilizados.

También definimos la FRR (razón de caudal) por la relación \(QR = \frac{{Q_{1} }}{{Q_{2} }}\). La mayor parte del trabajo se centró en FRR = 3, es decir, un caudal de agua tres veces mayor que el caudal de la solución de etanol. El caudal total Q se varió de 0,2 a 20 ml/min. Definimos una velocidad característica U como el caudal total Q dividido por la sección transversal del canal de entrada, es decir, justo antes del anillo 1 (ver Fig. 1). Los números de Reynolds y Dean se definen mediante las siguientes expresiones:

donde h es la altura del canal, ν es la viscosidad cinemática del agua y R es el radio de curvatura de los toros. En el rango de caudales que probamos, los números de Reynolds varían de 10 a 1100, mientras que los números de Dean oscilan entre 4 y 400. Por lo tanto, estábamos muy por debajo de los regímenes de desarrollo de turbulencia, lo que podría haber requerido un control fino de la rugosidad de la pared. Desde un punto de vista dimensional, nuestro sistema depende de estos dos números, junto con las relaciones de aspecto y un número adimensional que caracteriza el proceso de difusión. El espacio de parámetros es grande y, en este artículo, trazaremos los observables en función de los caudales (que, desde un punto de vista práctico, son útiles) sin intentar generalizar las conclusiones utilizando números adimensionales.

Para los experimentos con modelos de fluidos, la caracterización del proceso de mezcla se realizó utilizando técnicas de visualización. Se inyectó fluoresceína en una entrada y el líquido inyectado en la otra entrada no contenía colorante. El sistema se observó con un microscopio de fluorescencia equipado con una fuente a 480 nm y un filtro de cámara a 520 nm, es decir, alrededor del pico de emisión.

Como se hace clásicamente en la literatura19, el estudio del campo de intensidad de fluorescencia proporciona información sobre la mezcla. De manera similar, definimos un índice de mezcla H por la fórmula:

donde y es la coordenada transversal al flujo, w es el ancho del canal y \(I_{mean}\) es la intensidad promedio a lo largo del ancho del canal. Por definición, cuando H está cerca de la unidad, la mezcla es alta. En el caso contrario (H pequeña), la mezcla es baja.

Primero consideramos velocidades de flujo bajas, manteniendo la relación de velocidad de flujo FRR igual a 3. La elección de este valor estuvo motivada por el hecho, como se muestra más adelante, de que permitía la formación de LNP con los tamaños apropiados para la entrega de ADN o ARN ( aproximadamente 100 nm), una estrecha distribución de tamaño y una excelente eficiencia de encapsulación. En la figura 3A se muestra una imagen típica del campo de fluorescencia a caudales bajos.

(A) Campo de fluorescencia del micromezclador para un caudal total Q igual a 0,2 ml/min. Insertar: Distribución teórica del trazador si el tinte siguiera las líneas de corriente sin difusión, para lo cual asumimos que no hay recirculación. (B) Perfiles de intensidad en la sección de salida del sistema para Q = 0,2 (círculo abierto) y 0,3 (cruces) ml/min. La línea discontinua muestra el centro de la capa difusora y las áreas grises muestran las cuñas discutidas en la sección Materiales. Las mediciones se realizaron en el canal de salida, es decir, aguas abajo del cuarto anillo (ver línea discontinua). Las zonas grises son las cuñas del canal.

En la Fig. 3, el caudal Q2 de la solución de etanol es de 0,05 ml/min, mientras que se inyecta agua a un caudal Q1 igual a 0,15 ml/min, de manera que el caudal total Q = Q1 + Q2 es de 0,2 ml/ mín. Como se indicó anteriormente, la relación de caudales FRR es igual a 3. La Figura 3 indica que en el canal de entrada colector, los dos fluidos viajan uno al lado del otro. El perfil de intensidad en la Fig. 3B muestra la existencia de una capa difusa. El espesor medido de la capa difusa fue del orden de 60 µm, que fue mayor pero del mismo orden de magnitud que la estimación \(l \sim 6\sqrt {DT }\) de las capas difusas según la función de error ( donde D es la constante de difusión de fluoresceína en etanol (2 10–10 m2/s) y T es el tiempo de viaje (30 ms para 0,2 ml/min)). La fórmula conduce a un espesor l del orden de 30 µm. Sugerimos que el factor de 2 se debe a la acción de recirculaciones débiles, presentes en el sistema incluso a caudales bajos, localizadas en la entrada o desarrollándose a lo largo de los anillos. Por pequeñas que sean estas recirculaciones, pueden mejorar significativamente el transporte por difusión.

La figura 3A muestra que el etanol y el agua fluyen uno al lado del otro. En tal régimen, valen las siguientes expresiones19,20.

donde µe y µw son las viscosidades del etanol y el agua, respectivamente. La fórmula dice que la mezcla de etanol de fluoresceína ocupa el 30% del ancho del canal. Esto se compara bien con la Fig. 2, en la que la línea discontinua que marca el centro de la capa difusa se encuentra en el 35 % del ancho del canal. El recuadro en la Fig. 3A muestra el patrón de flujo que esperaríamos si no hubiera movimiento de remolino y si se despreciara la difusión.

A medida que la tasa de flujo total Q aumentó en el rango de 0,7 a 4 ml/min, aún con FRR = 3, los perfiles de concentración promediados en el tiempo adoptaron formas complicadas que variaban sustancialmente de una tasa de flujo a otra, aunque las diferencias entre dos valores sucesivos fueron tan pequeños como 10%. Por lo tanto, existe una alta variabilidad en esta región. Llamamos a este dominio el 'dominio de transición' ya los regímenes correspondientes 'regímenes de transición'. La figura 4A muestra un campo de concentración típico y la figura 4B un perfil de concentración típico obtenido en este régimen, medido nuevamente, en el microcanal de salida (ver flecha).

Campo de fluorescencia de fluoresceína transportada en el dispositivo por etanol para Q1 = 1,5 ml/min (agua) y Q2 = 0,5 ml/min (etanol): (A) Imagen instantánea del campo de fluorescencia. (B) Perfil de intensidad promediado en el tiempo (más de un minuto) medido después del cuarto anillo (ver la flecha), es decir, en el canal de salida. Las zonas grises son las cuñas del canal.

En este caso, el trazador invadió el canal pero no completamente: el perfil de concentración, que se promedia en el tiempo durante un minuto, muestra una caída pronunciada alrededor de la línea central. Por lo tanto, la mezcla no fue completa porque algunas regiones estaban bien mezcladas y otras menos mezcladas. Una observación importante es que en el régimen de transición, la fluoresceína invadió el canal antes de ingresar al primer toro. Esto sugiere que se desarrolló un mecanismo de transporte en la unión donde se encontraron los dos fluidos. Como se indica en la Fig. 3A, la concentración de tinte tendió a homogeneizarse a medida que avanzamos río abajo, pero aún quedaban heterogeneidades en el canal de salida, como se muestra en la Fig. 3B.

Una característica interesante que observamos en el rango de 1 a 4 ml/min fue la presencia de fenómenos dependientes del tiempo, como se muestra en la figura 5.

(A) Imagen de fluorescencia instantánea tomada justo antes del Anillo 2 para Q = 1,5 ml/min, manteniendo siempre la FRR igual a 3. (B) Intensidad instantánea medida en el punto indicado por la flecha en la figura de la izquierda. Las posiciones de las interfaces nítidas variaron con el tiempo, dando lugar a oscilaciones en la intensidad de fluorescencia local que aparecían en el gráfico de intensidad-tiempo. Los números de Reynolds correspondientes a los caudales que se muestran en el gráfico son, del caudal más bajo al más alto, 11, 80 y 330.

Para obtener la Fig. 5, medimos la intensidad instantánea de la fluorescencia en un punto fijo para diferentes caudales. La posición del punto de medición se indica con un punto blanco en la Fig. 5A. La figura 5B muestra que a 0,2 ml/min no hubo oscilación significativa de la intensidad local. A 1,5 ml/min, eran visibles las oscilaciones locales inducidas por los desplazamientos de la interfase fluoresceína/agua. Su amplitud desapareció a velocidades de flujo más altas (ver la curva a 6 ml/min). Estas medidas proporcionan evidencia de la presencia de fenómenos dependientes del tiempo en el sistema. Se desarrollaron en un estrecho rango de caudales, situados aproximadamente entre 1 y 4 ml/min. Nuestra hipótesis es que a velocidades de flujo más grandes, el flujo aún era inestable, pero el acoplamiento entre las oscilaciones hidrodinámicas, que tienden a estriar el campo de fluorescencia, como se observa actualmente en la mezcla caótica19, y la difusión molecular, que lo suaviza de manera eficiente, eventualmente produjo un campo de concentración homogéneo. El caso límite de mezcla completa está bien ilustrado en la Fig. 6A.

(A) Campo de fluorescencia desarrollado por el micromezclador para Q = 20 ml/min; (B) Tres perfiles de concentración promediados en el tiempo obtenidos para Q igual a 6 (círculos), 14 (cruces) y 20 (más) ml/min. Las zonas grises son las cuñas del canal.

La figura muestra que el trazador, además de una pequeña región alrededor del primer anillo, se distribuye homogéneamente por todo el dispositivo. Los perfiles de concentración correspondientes se muestran en la Fig. 6B para tres caudales, 6, 14 y 20 ml/min, aún manteniendo FRR = 3. Estos perfiles, nuevamente medidos al nivel del canal colector, cerca de la salida (ver la línea discontinua en la Fig. 6A), colapsan una sobre otra.

La figura 7 representa la evolución del factor de homogeneidad H, definido anteriormente, medido en el canal de salida para un rango de caudales que abarcan los tres regímenes seleccionados, manteniendo de nuevo la relación de caudales FRR = Q1/Q2 igual a 3.

Evolución del índice de mezcla H en función del caudal total Q para una FRR igual a 3, con imágenes instantáneas típicas de fluoresceína. Cada punto resulta de un promedio de un minuto. La línea completa se ha trazado para guiar los ojos.

Los datos están graficados en escala semilogarítmica, y el factor de homogeneidad H se obtuvo excluyendo las cuñas, considerando, como se dijo anteriormente, que no contribuyen significativamente al proceso productivo. Los tres regímenes que identificamos a partir de estas mediciones son los siguientes:

Q < 0,4 ml/min: Mala mezcla, asociada con flujos uno al lado del otro. El factor de homogeneidad H es pequeño, aproximadamente un pequeño porcentaje. El número de Reynolds superior correspondiente de este régimen es 22.

0,4 < Q < 4 ml/min: Régimen de transición, asociado a una mezcla moderada, junto con perfiles de concentración complejos y fenómenos dependientes del tiempo. El factor de homogeneidad H se encuentra entre 20 y 80%. En términos de números de Reynolds, el dominio oscila entre 22 y 220. La variación de H de una medida a otra, aunque se promedian en tiempos largos con respecto al tiempo característico de la oscilación, es típica de sistemas en los que las inestabilidades de flujo desarrollar. Esta dispersión es consistente con las observaciones hechas anteriormente sobre la variabilidad de los perfiles de concentración con las condiciones de flujo.

Q > 4 ml/min: Régimen muy mixto con factores de homogeneidad superiores al 80 % y perfiles de concentración planos y reproducibles. El rango del número de Reynolds se encuentra entre 220 y el valor máximo alcanzado en el experimento, es decir, 1100.

Para discutir la Fig. 7, es interesante dividir el sistema en dos partes, como se muestra en la Fig. 1B:

Sección 1: La región de entrada, incluida la unión en V y el canal de conexión al primer anillo.

Sec 2: El resto del sistema, incluidos los anillos, las uniones entre dos anillos sucesivos y el microcanal de salida.

Nuestras observaciones pueden compararse con las de Minakov18, en las que se inyectaron dos fluidos miscibles en una unión en T en un canal recto. Por lo tanto, la geometría era similar a la nuestra, excepto que usamos una unión en Y en lugar de una unión en T. Los resultados de este trabajo fueron cualitativamente confirmados experimentalmente21. De acuerdo con estas referencias, por encima de un cierto umbral estimado en Re ≈ 20, se desarrollan vórtices simétricos de tipo Dean en forma de S en la unión. Este umbral está cerca del nuestro (estimado en 22). Por encima de este régimen, se desarrolla un patrón estacionario asimétrico, hasta Re ≈ 150. El desarrollo de inestabilidades oscilatorias aparece en 240, induciendo un desplazamiento periódico de un punto de silla que, según el escenario de Poincaré-Melnikov, da lugar a una mezcla caótica. En efecto, el trabajo de Minakov muestra una mezcla eficiente justo después del inicio de los flujos dependientes del tiempo18. Este rango de números de Reynolds es consistente con el régimen que llamamos "régimen de transición", en el que el régimen de flujo lateral no se mantiene, la mezcla es moderada, hay heterogeneidades y se desarrollan oscilaciones. En nuestro caso, el régimen de transición se extiende desde un número de Reynolds igual a 22–220, que no es tan amplio como los resultados de Minakov pero es consistente con ellos. Por lo tanto, podemos sugerir que nuestro 'régimen de transición' abarca remolinos con forma, remolinos asimétricos y remolinos oscilantes. Se sabe que los remolinos oscilantes son extremadamente eficientes desde la perspectiva de la mezcla19. Esto puede explicar por qué, justo por encima del inicio de las oscilaciones, alcanzamos lo que llamamos 'regímenes altamente mixtos'. Por tanto, la comparación con el trabajo de Minakov proporciona pistas para entender, de forma semicuantitativa, el comportamiento de nuestra micromezcladora.

Hay evidencia de que los cuatro anillos mejoran la homogeneización del tinte. Esto se ilustra en la Fig. 5, que muestra que las faltas de homogeneidad en la entrada del dispositivo tienden a suavizarse a medida que avanzamos aguas abajo. En los anillos se pueden distinguir dos partes: una es el propio anillo (Parte 1), y la otra (Parte 2) es el canal colector, es decir, la región donde los dos fluidos se encuentran nuevamente. La parte 1 probablemente juega un papel menor en la mezcla porque, en comparación con las uniones (es decir, la parte 2 o la entrada en V), la curvatura es más pequeña y, por lo tanto, los vórtices de Dean que pueden desarrollarse son más débiles. Por otro lado, la Parte 2 puede considerarse como una unión en Y, que desempeña un papel similar al de la entrada, mejorando así la mezcla. De hecho, las observaciones experimentales que hicimos sugieren que los eventos de mezcla comienzan primero en la entrada, es decir, en la Secc. 1, y repite en la Parte 2 de los anillos. Por lo tanto, podemos sugerir que la Parte 2 complementa el trabajo realizado por la Parte 1 con respecto a la mezcla, pero no lo inicia.

La pregunta que ahora abordamos es la relación entre las características de mezcla analizadas previamente y las propiedades LNP obtenidas con el mismo micromezclador. Para realizar estas investigaciones, se utilizó un modelo LNP-pDNA. Los LNP se fabricaron utilizando el plásmido gWiz-GFP listo para usar y comercialmente disponible22,23 y cuatro lípidos diferentes con proporciones molares óptimas de lípido ionizable/DSPC/colesterol/PEG-lípido de 50/10/38,5/1,5 y un N /P relación de 6 para el grupo amina de lípido ionizable a los grupos fosfato de pDNA como se describe en la literatura24,25. Se eligió el lípido ionizable MC3 (DLin-MC3-DMA) porque es el sistema de administración de oligonucleótidos clínicamente más avanzado26,27 y también está disponible comercialmente. La relación molar entre todos los componentes se mantuvo constante y se eligió de acuerdo con la literatura.

Por lo tanto, investigamos el efecto de la tasa de flujo total Q en el tamaño de LNP, la variabilidad del tamaño (PDI: índice de polidispersidad), el potencial ζ y la eficiencia de encapsulación (EE). Este trabajo representa los 'experimentos LNP' definidos anteriormente. Estas características clave suelen medirse desde las primeras etapas de desarrollo para controlar el proceso y garantizar la eficacia y seguridad del producto final. Según la literatura, idealmente, los tamaños de LNP deberían ser de aproximadamente 100 nm o menos para garantizar una biodistribución óptima y una administración eficaz del fármaco28; PDI debe ser inferior a 0,2 para certificar la homogeneidad del producto; y los potenciales zeta deben ser ligeramente negativos y la eficiencia de encapsulación lo más alta posible para garantizar un alto rendimiento del proceso y protección del ácido nucleico.

Para analizar la correlación de estos parámetros con las condiciones de flujo, se estudiaron cinco caudales Q que van desde 0,4 ml/min hasta 20 ml/min. En estos experimentos, de la misma manera descrita anteriormente, la relación entre las corrientes acuosa y disolvente se mantuvo igual a 3, y la concentración de lípidos totales (1,44 mg/l) y la composición química se mantuvieron constantes. Los datos se muestran en la Fig. 8.

Evolución de varias cantidades con el caudal, entre 0,4 y 20 mL/min (A) Tamaños LNP; (B) PDI (índice de polidispersidad de los LNP); (C) Eficiencia de encapsulación.

La Figura 8A muestra que se obtuvieron partículas más grandes a bajo Q (< 1 ml/min). Después de una zona de transición en la que los tamaños parecían disminuir, los tamaños de las partículas alcanzaron una meseta a aproximadamente 100 nm a velocidades de flujo más altas, es decir, entre 4 y 20 ml/min. Mientras tanto, la dispersión de nanopartículas (PDI) disminuyó con el aumento de la velocidad de flujo, estabilizándose para Q > 4 ml/min al 7 % (ver Fig. 8B). Paralelamente, el EE estaba aproximadamente un 60 % por debajo de 2 ml/min, mientras que las partículas formadas a mayor Q, por encima de 4 ml/min, tenían un EE de aproximadamente un 80 % (ver Fig. 8C). Estos resultados fueron consistentes con los resultados del estudio de mezclado que realizamos. Hemos trazado, en el mismo gráfico, los límites de las tres zonas que destacamos en la Fig. 7, es decir, las regiones poco mezcladas, de transición y altamente mezcladas. En particular, las características de la estructura LNP se correlacionan bien con las características de mezcla del dispositivo. Además, también se midió el potencial ζ, que indica la carga superficial efectiva29. Independientemente del caudal utilizado, todos los LNP exhibieron un potencial zeta de ζ = − 13 mV +/− 4 mV a pH 7,4 y, por lo tanto, fueron ligeramente negativos. La medida fue consistente con Ref25 y sugirió una pérdida de la carga positiva del lípido ionizable.

Podemos concluir, desde una perspectiva práctica, que cuando la mezcla no es satisfactoria (es decir, con un índice de homogeneidad H inferior al 80%), las propiedades de las estructuras que se crean no son óptimas, mientras que alcanzan un óptimo cuando la mezcla es alta. (H superior al 80%) y los perfiles de intensidad son homogéneos en todo el canal. Sugerimos que trabajar por encima de la zona de transición, más específicamente, sustancialmente por encima de las condiciones para las cuales se desarrollan los flujos oscilatorios, conduce a LNP óptimos.

Es importante, como se describe en Roces et al.5, abordar el papel de la relación de caudales FRR. La figura 9 muestra los resultados obtenidos para el diámetro D de LNP, el PDI y la eficiencia de encapsulación EE para un caudal total de 4 ml/min y diferentes valores de FRR, que varían de 1 a 10.

Gráficos obtenidos para un caudal total de Q = 4 ml/min. (A) LNP diámetro D en función de FRR (es decir, relación de caudal de solución de agua sobre etanol). Recuadro: PDI en función de FRR. (B) eficiencia de encapsulación EE en función de FRR. Recuadro: Factor de homogeneidad H en función de FRR. (C): cantidades normalizadas representadas en función de \(\varepsilon_{m} = \frac{{FRR\varepsilon_{w} + \varepsilon_{e} }}{FR + 1}\); \(D^{*} = 1 + 4\frac{{D - D_{\infty } }}{{D_{\infty } }}\left( + \right);\) \(PDI^{*} = PDI/PDI_{\infty }\)(o) y \(EE^{*} = E_{\infty } /EE\) (x).

Para una FRR menor que 2, las características de LNP no fueron "óptimas" (en el sentido definido anteriormente): diámetros superiores a 100 nm (Fig. 9A), bajo EE (recuadro de la Fig. 9B) y alto PDI (Fig. 9C) fueron observados. A mayor FRR, recuperamos las características óptimas, es decir, diámetros cercanos a 100 nm, EE grande y PDI pequeño (del orden del 6%). Es importante señalar, como se muestra en el inserto de la Fig. 9B, que en todos los casos, es decir, en todas las FRR, la mezcla fue alta: el factor de homogeneidad H fue en promedio de aproximadamente 80%. Podemos inferir que el origen de las patologías estructurales del LNP, para FRR < 2, no se debió a una mezcla insuficiente.

La figura 9C nos permite proponer una explicación. Cuando se mezclan etanol (constante dieléctrica relativa εe = 25) y agua (constante dieléctrica relativa εw = 78), la constante dieléctrica efectiva (relativa) de la mezcla es igual a \(\varepsilon_{m} = \frac{{FRR\ varepsilon_{w} + \varepsilon_{e} }}{FR + 1}\). La Figura 10C muestra la evolución del diámetro D, PDI y eficiencia de encapsulación EE en formas normalizadas en función de \(\varepsilon_{m}\). Específicamente, representamos las siguientes cantidades: \(D^{*} = 1 + 4\frac{{D - D_{\infty } }}{{D_{\infty } }},\) \(PDI^{* } = PDI/PDI_{\infty }\), y \(EE^{*} = E_{\infty } /EE\), donde '\(\infty^{\prime }\) es el valor obtenido en FRR > 4 ml/min. A una FRR alta, \(\varepsilon_{m}\) es similar a la del agua, y los LNP tienen propiedades óptimas, mientras que a una FRR pequeña, \(\varepsilon_{m}\) es sustancialmente menor, el panorama energético 'visto ' por los constituyentes de LNP se modifica, y podemos plantear la hipótesis de que esto afecta el proceso de autoensamblaje y, por lo tanto, las morfologías de LNP de manera perjudicial. Este tipo de situación ocurre cuando se utilizan cantidades importantes de etanol en la formulación24,30,31,32. De la Fig. 9C, estimamos que el cruce entre los casos óptimo y no óptimo se ubica alrededor de una constante dieléctrica relativa efectiva \(\varepsilon_{m}\) cercana a 60, aún para Q = 4 ml/min, que corresponde a una relación de caudal (FRR) del orden de 2.

Imágenes crio-TEM de LNP compuestos por MC3, DOPC, PEG-lípido y colesterol con una composición molar de 50/10/1,5/38,5, respectivamente, obtenidas a diferentes caudales y con una FRR de 3. (A) LNP preparados en la ausencia de ácido nucleico a 4 ml/min. (B) Sistemas pDNA-LNP preparados con p-DNA a 4 ml/min, que muestran superficies más texturizadas. (C) Sistemas pDNA-LNP preparados a 0,4 ml/min. Los tamaños son más grandes y las distribuciones más amplias (ver la presencia de LNP pequeños y grandes).

A partir de esta observación, podemos sugerir que, de manera óptima, la FRR debe ser simultáneamente lo suficientemente grande para mantener la polaridad de la solución cercana a la del agua y lo suficientemente pequeña para evitar alcanzar diluciones altas, lo que disminuiría el rendimiento del proceso.

Aquí, analizamos la morfología de las nanopartículas producidas en los regímenes altamente mixtos a 4 mL/mn y FRR = 3. Usamos cryo-TEM, considerando, en aras de la comparación, LNP sin pDNA (LNP "vacío") y con ácidos nucleicos (pDNA LNP). También comparamos los resultados con los de regímenes mal mixtos, como se muestra en la Fig. 10.

En los regímenes bien mezclados, el tamaño (cercano a 100 nm) observado por cryo-TEM fue consistente con las mediciones de DLS. Descubrimos que los LNP vacíos tenían formas esféricas suaves, mientras que los LNP de ADNp mostraban una interfaz corrugada (Fig. 10B). Es probable que la acción de las hebras de ADN encapsuladas sobre la capa lipídica provoque este fenómeno. En cualquier caso, encontramos que la estructura del núcleo densa en electrones de la Fig. 10 era consistente con los LNP funcionales basados en ácido informados en la literatura5,8,24,33. Por lo tanto, podemos concluir que en condiciones altamente mixtas y con FRR = 3, las estructuras que encontramos son "óptimas" en el sentido de que son consistentes con los LNP funcionales representados en la literatura. Cuando los LNP se preparan en condiciones de baja mezcla (0,4 ml/min, "régimen de lado a lado"), se observan los mismos tipos de estructuras, pero las poblaciones parecen adoptar tamaños más grandes, con distribuciones más amplias, de acuerdo con la Fig. 8A.

Los resultados presentados anteriormente indican que se obtiene una calidad de LNP aceptable (tamaño bajo, PDI bajo, potenciales ζ débilmente negativos y EE alto) cuando se cumplen dos condiciones: una mezcla homogénea de las dos fases utilizadas para formular el LNP, con un factor de homogeneidad mayor superior al 80%, y una distribución de fase tal que la constante dieléctrica relativa media de la mezcla sea superior a 60. Este es el rango de condiciones que podemos recomendar para preparar LNP funcionales. Nuestros resultados sugieren que, independientemente de la geometría del mezclador, si una de las dos condiciones no se cumple, los tamaños de LNP, la homogeneidad del tamaño y la eficiencia de encapsulación diferirán sustancialmente de los valores óptimos.

Es interesante preguntarse por qué, a caudales bajos, LNP anómalos. Poseen tamaños significativamente más grandes y eficiencias de encapsulación más pequeñas que las estructuras óptimas que se obtienen. El perfil de fluorescencia de la Fig. 3 muestra la presencia de una capa difusa, de 60 μm de espesor, que separa los dos fluidos. En el centro de esta capa, la relación agua/etanol es de aproximadamente 1:1. Podemos inferir que en esta región no se cumplen las condiciones óptimas de autoensamblaje. Por otro lado, los lípidos y el pDNA son más masivos que el agua y el etanol y, por lo tanto, se difunden más lentamente. A medida que los reactivos viajan aguas abajo, habrá períodos de tiempo en los que los lípidos experimenten este entorno subóptimo y, por lo tanto, se precipiten. Este razonamiento puede explicar los tamaños anómalos y los bajos rendimientos observados en los regímenes de mezcla deficientes.

En particular, a las tasas de flujo más altas que impusimos, los LNP mantuvieron su integridad, lo que indica que no se rompieron. Esto puede entenderse observando que, a pesar de la alta velocidad (es decir, cm/s), en la escala del LNP, es decir, 100 nm, los esfuerzos cortantes son bajos. Si aumentáramos el tamaño del sistema, no habría dificultad para aumentar la tasa de flujo y, por lo tanto, el rendimiento, siempre que el esfuerzo cortante 'visto' por el LNP permanezca al mismo nivel que en nuestros experimentos, y las condiciones de flujo permanezcan por debajo de la turbulencia. comienzo.

Finalmente, al usar la comprensión que obtuvimos en este trabajo, podemos intentar definir las condiciones óptimas para producir LNP para el tipo de mezclador que usamos. Primero, la tasa de flujo debe ser lo suficientemente grande para lograr una alta mezcla. En nuestro caso, se puede proponer un caudal mínimo de 4 ml/min. En segundo lugar, el dispositivo debe ser lo suficientemente largo para que el proceso de mezcla se desarrolle por completo. Nuestro trabajo sugiere que treinta veces la dimensión transversal es aceptable. Finalmente, el FRR debe ser lo suficientemente grande para mantener la polaridad media cercana al agua, sin operar con factores de dilución elevados, que generarían residuos. En nuestro sistema, podemos proponer un FRR del orden de 3.

El artículo analiza, con cierta profundidad, el proceso de mezcla que se desarrolla a lo largo de un dispositivo que incorpora una unión en Y y cuatro anillos. En el contexto de LNP, esta es la primera vez. El dispositivo que analizamos pertenece a la categoría de micromezcladores inerciales, es decir, micromezcladores que aprovechan la acción de los vórtices inerciales (Dean) y, mientras tanto, funcionan por debajo del inicio de la turbulencia. Estos mezcladores están bien adaptados a altos rendimientos, una condición clave para contemplar la producción en masa. Dichos rendimientos no se pueden lograr, por ejemplo, con el micromezclador en espiga. En este artículo, mostramos que los fenómenos dependientes del tiempo se desarrollan por encima de cierto umbral, cerca del trabajo numérico de Minakov et al.18. Nuestro análisis del proceso de mezcla, junto con las mediciones de LNP, indica que las condiciones óptimas para producir estructuras funcionales requieren tasas de flujo sustancialmente superiores al inicio de los fenómenos dependientes del tiempo. La razón es que, como se establece en la literatura sobre el caos (ver, por ejemplo, Ref19), los remolinos oscilatorios dan lugar a una mezcla eficiente. Sugerimos que el criterio que proponemos aquí (que opera por encima del inicio de los regímenes de flujo oscilatorio) es general. Debería ser útil para diseñar micromezcladores de alto rendimiento dedicados a la producción de LNP.

Los conjuntos de datos analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Los autores agradecen a La Ville de Paris, SANOFI, ESPCI, CNRS, PSL e IPGG por su apoyo. Agradecen a los miembros del grupo MMX por las discusiones ya L. Dehove por las cifras.

La palabra cuenta con el apoyo de CNRS, PSL, plataforma IPGG, ESPCI y una subvención de SANOFI.

Departamento BioDPD, SANOFI, 13 Quai Jules Guesde, 94400, Vitry-sur-Seine, Francia

Manon Ripoll, Mathilde Enot, Oscar Robbe, Chiara Rapisarda, Jean-René Authelin, Mostafa Nakach y Pierre Wils

Microfluídica, MEMS, Laboratorio de Nanoestructuras, CNRS Química Biología Innovación (CBI), UMR 8231, Instituto Pierre Gilles de Gennes (IPGG), ESPCI París, Universidad de Investigación PSL, 6 rue Jean Calvin, 75005, París, Francia

Elián Martín y Patrick Tabeling

Departamento REI, SANOFI Pasteur, 1541 Av. Marcel Mérieux, 69280, Marcy-L'Etoile, Francia

Marie-Claire Nicolai y Aurélie Deliot

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MR, EM, ME, OR, CR, MCN, AD estaban realizando los experimentos; PT, JRA, MN, PW discutieron los resultados y administraron el proyecto.

Correspondencia a Patrick Tabeling.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Ripoll, M., Martín, E., Enot, M. et al. Autoensamblaje óptimo de nanopartículas lipídicas (LNP) en un micromezclador de anillo. Informe científico 12, 9483 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13112-5

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Recibido: 09 febrero 2022

Aceptado: 20 de mayo de 2022

Publicado: 08 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13112-5

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